mRNA疫苗的工作原理是將含有編碼目標蛋白的mRNA片段,以特殊的脂質膜包裹,注入人體細胞內產生抗原,再由此激發特異性免疫反應,達到形成免疫記憶的效果。相比於其它疫苗來說,具有安全性高、保護率高、研發週期短、生產效率高等優勢。mRNA疫苗的開發生產包括序列設計、mRNA體外合成、mRNA包封等步驟。其中,mRNA體外合成所需的原料酶對於生產高品質的mRNA疫苗起著至關重要的作用。KactusBio提供全系列的GMP&非GMP原料酶,助力mRNA疫苗的產業化生產。

A. mRNA體外轉錄

體外轉錄（in vitro transcription, IVT）是以線性化質粒為範本，在RNA轉錄酶、NTP等條件下，模仿體內轉錄過程生成mRNA的技術。質粒範本通常使用的啟動子為T7啟動子，其轉錄強度較高，是目前原核表達應用最廣泛的啟動子。T7 RNA Polymerase（T7 RNA聚合酶）對T7啟動子具有高度特異性，且其活性較高，在Inorganic Pyrophosphatase、Murine RNase Inhibitor、DNase I的輔助下，合成高產量的mRNA。

• T7 RNA Polymerase（DMF Filed）
  本品為大腸桿菌重組表達的T7噬菌體DNA編碼的蛋白，是一種高度特異性識別T7啟動子序列（5’ -TAATACGACT CACTATAGGG-3’ ） 的 DNA依賴的5´→3´RNA聚合酶。 以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為範本， NTP為底物，合成與啟動子下游的單鏈DNA或雙鏈DNA範本鏈互補的RNA。 T7 RNA Polymerase DMF備案編號為037660。


• Pyrophosphatase，Inorganic
  本品是重組大腸桿菌表達酵母來源的無機焦磷酸酶（PPase），催化一分子焦磷酸鹽轉化為兩分子磷酸鹽離子，使無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽。在分子生物學中可用於體外轉錄反應中提高mRNA產量。


• Bsa I（DMF Filed）
  線性化範本可通過限制性內切酶酶切質粒獲得，需確保酶切產物為平末端或5’端突出結構。需使用IIS型限制性內切酶，IIS型限制性內切酶的酶切位點在識別位點以外，酶切完5’端突出。BsaI屬於IIS型限制性內切酶，它的識別位點為6個堿基組成，具有高度特異性而極不容易出現‘類’酶切位點，能夠有效避免出現非特異性的酶切。 BsaI DMF備案編號為037503。


• Murine RNase Inhibitor
  本品是在大腸桿菌中表達純化的Murine RNase Inhibitor，能抑制 RNase A, RNase B 或 RNase C 這三種酶的活性，主要參與mRNA體外轉錄中對mRNA的保護。


• DNase I
  DNase I是一種可消化單鏈或雙鏈DNA的去氧核糖核酸內切酶，它識別並切割磷酸二酯鍵，產生5´-磷酸基團和3´-OH的單去氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡去氧核苷酸。

B. mRNA加帽系統

體外轉錄的mRNA的5’端含有三磷酸基團，具有很強的免疫原性，若將其遞送至體內，會啟動固有免疫應答，RIG-1會識別三磷酸基團，導致其無法在體內正確翻譯出抗原蛋白。因此，在工業生產中需對mRNA進行加帽修飾以逃避固有免疫系統。使用酶法進行加帽，首先應使用Vaccinia Capping Enzyme將mRNA修飾成（m7Gppp5´N）Cap0帽子結構，它對翻譯起始因數eIF4的招募過程起著非常重要的作用，而且可有效防止mRNA被降解；再進一步使用mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase，在mRNA 5´末端緊挨Cap0帽結構的第一個核苷酸的 2´-O 位置進行甲基化，得到（m7Gppp5´mN）Cap1帽子結構，Cap1的免疫原性比Cap0低，不易被RNA sensors識別。

C. mRNA加尾修飾

mRNA的修飾除了加帽修飾還有加尾修飾，poly（A）尾可以穩定mRNA的結構，也可以為mRNA識別核糖體提供信號，從而提高翻譯效率。體外轉錄mRNA的加尾方式有兩種，一種是在設計序列的時候就引入poly（A）序列，一種是使用 Poly(A) Polymerase進行加尾。

Poly(A) Polymerase
本品是由大腸桿菌重組表達的Poly(A) Polymerase，催化ATP以AMP的形式添加至mRNA的3´端。

環狀RNA ( circRNA ) 普遍存在於各類生物中,其分子呈共價閉環結構,具有線性RNA ( linear RNA ) 無法比擬的穩定性,極大程度避免了核酸外切酶對它的降解。對於circRNA疫苗來說,需要注意兩個關鍵問題:一是需提高體外環化的效率,二是需關注circRNA的免疫原性。

環狀RNA ( circRNA ) 普遍存在於各類生物中,其分子呈共價閉環結構,具有線性RNA ( linear RNA ) 無法比擬的穩定性,極大程度避免了核酸外切酶對它的降解。對於circRNA疫苗來說,需要注意兩個關鍵問題:一是需提高體外環化的效率,二是需關注circRNA的免疫原性。

GMP級Cas9核酸酶（DMF Filed）

基因編輯技術已歷經幾代革新,從最初的ZFNs(zinc-finger nucleases)技術、TALENs (transcription activator-like effector nucleases)技術到CRISPR-Cas技術,再到BE ( base editing)技術及PE ( prime editing)技術等,極大地提高了人類對真核細胞的基因組進行精准改造的能力。其中,CRISPR-Cas系統由於設計和操作簡便,已成為基因治療領域中重要的技術手段。Kactub Bio自主開發了GMP級Cas9核酸酶以及高活性的Cas12a核酸酶,其中,Cas9核酸酶已完成美國FDA DMF備案(編號:036578),加速基因治療藥物申報。

產品特點

Kactus MaxNuclease是來自於Serratia Marcescens的廣譜核酸酶，可降解雙鏈、單鏈、環狀和線性RNA和DNA等任意形式的核酸，將它們消化為3-5個堿基長度的5’-單磷酸寡核苷酸。本品利用 大規模發酵表達純化，生產過程完全按照GMP生產標準進行，是病毒類疫苗、病毒載體治療等行業中去除核酸的不二選擇！MaxNucleaseDMF備案編號為036799。

• GMP級別產品，藥典標準放行檢測，滿足從研發到商業大規模生產的使用需求
• 按照藥典標準的檢測方法學開發和驗證，未使用抗生素和動物源原材料
• FDA DMF Filed
• 高純度、高活性，可消化任何形式的DNA和RNA
• 高標準的CGT原料酶GMP生產廠房

主要應用

CAR-T靶點蛋白

CAR-T是嵌合抗原受體修飾T細胞，為一種新型的免疫治療方法，通過基因工程表達一種嵌合抗原受體CAR，能識別特定的腫瘤相關抗原(TAA)，已在多種血液系統惡性腫瘤的治療中取得了顯著的成功。基於特色的SAMSTM平臺，愷佧生物開發出一系列覆蓋多個CAR-T細胞治療靶點的重組蛋白，包括定點標記蛋白、螢光標記蛋白、生物素標記蛋白及不同標籤等多種產品類型，可靈活滿足CAR-T陽性率檢測等不同藥物研發需求。

Kactus擁有專屬的新型功能重組蛋白和高活性蛋白酶類研發生產平臺Structure Aided Design and Multiplex Screening（SAMSTM），聚焦于全球創新藥研發企業客戶， 提供基於結構設計的功能靶點蛋白和用於細胞和基因治療以及mRNA疫苗生產過程中需要的關鍵蛋白酶原料。